疟疾是全球性的大麻烦，而疟原虫在肝脏里的这段潜伏期，就是治病的关键窗口期，也是搞疫苗的重中之重。过去搞研究，大家都爱用那种带荧光标签的转基因疟原虫，因为看着明显。但现在临床转化的时候，监管部门说不许用这些标签了，这让传统的流式检测没法用了。为了能在不用荧光标记的情况下精准检测肝脏感染，研究团队弄了一套行之有效的实验流程。他们先找来Huh7和HepG2这两种人肝癌细胞系当模型，提前养着，再把伯氏疟原虫的子孢子加进去。然后在室温下用600g的转速离心5分钟，把它们赶进细胞里。之后放到37℃、5%CO₂的环境里培养2小时，换个有抗生素的新培养基接着养，养到24小时或者48小时就把细胞捞起来。 把细胞消化开、离心重新混悬好后，倒进96孔的U底板里。先用IC固定液在4℃里固定20分钟，再用破膜缓冲液处理一下让细胞膜破掉。接着用人Fc受体封闭液在4℃封闭30分钟，防止抗体瞎结合。这一步要是没做好，后面的染色就白忙活了。胞内染色是关键环节，研究用了一抗和二抗分步孵育的策略。先用抗疟原虫HSP70的小鼠单克隆抗体和抗UIS4的山羊多克隆抗体在4℃孵育30分钟，洗干净后再加入驴抗小鼠Alexa Fluor Plus 647和驴抗山羊R-PE这种带荧光的二抗继续孵育。最后把细胞悬在流式缓冲液里用流式仪测。 数据怎么看呢？拿没感染的唾液腺细胞当阴性对照，用前向散射和侧向散射把门画好，把粘连的细胞碎片都给排除掉。看HSP70或者UIS4阳性的比例就能知道感染率是多少，看几何平均荧光强度（gMFI）就能知道疟原虫在肝细胞里长了多大。这套方法经过反复验证挺靠谱的：在荧光疟原虫模型里，HSP70和UIS4阳性的比例跟GFP阳性的比例非常一致，而且随着子孢子加得越多比例就越高；这两种标记物的平均荧光强度也跟着感染时间变长而变强，跟疟原虫在肝里繁殖的速度一样。 更厉害的是，这套方法能清清楚楚地分辨野生型、辐射减毒的还有早期或者晚期基因减毒的全子孢子疫苗株。它的结果跟RT-qPCR测的虫体数量、还有显微镜下看到的虫体大小都很合拍，说明它既能数清有多少虫子感染了，又能看出虫子发育到了哪一步。从实际应用来说，它解决了全子孢子疫苗研发的大难题。这种疫苗因为不用外加的报告基因，以前的荧光流式根本测不出来；而RT-qPCR和显微镜又太慢太费钱、通量又低。相比以前的老办法，这个新技术的好处在于好用还合规，不用折腾疟原虫的基因，不管是野生型还是减毒株都能用；操作步骤也是标准化的，UIS4抗体买现成的就行。