细胞培养最怕的就是污染，这简直就是个魔咒。一旦有了细菌、真菌、霉菌、支原体或者黑胶虫这些小妖怪，之前所有的努力都白费了。要想避开这个坑，必须先搞清楚污染源。咱们把最常见的五种污染情况都说说，还有应对的法子。 细菌污染特别明显，镜下能看到小黑点或者沙粒一样的东西，培养液发黄发浑，有时候还会飘出臭鸡蛋味。遇到这种情况赶紧在培养基里加抗生素（四环素50微克/毫升或者庆大霉素50微克/毫升，链霉素100微克/毫升），不过这药也伤细胞，细胞状态下滑就很难恢复了。最好的办法还是预防为主，无菌操作再严谨一点，台面、瓶口、枪头都要保持清洁。 真菌污染早期可能看不出来，但镜下能看到丝状或者珊瑚状的菌丝。一旦发现这种情况，立刻把整瓶培养液扔掉，别心存侥幸。接着把培养间、孵箱、器皿用酒精和新洁尔灭彻底消毒一遍，硫酸铜饱和水盘可以抑制孢子再飞散。 霉菌也喜欢清澈的培养液，镜下能看到像柳絮一样的漂浮物。处理方法和真菌一样，果断舍弃加上深度消毒。先把孵箱用酒精擦干净，再用新洁尔灭二次擦洗。 支原体污染的时候培养液看起来很清澈，但细胞状态会突然变差。这种情况如果不是特别珍贵的细胞系就直接丢掉算了。如果非要抢救一下可以换批号血清加上抗生素预处理一下。 黑胶虫这种东西对细胞没直接毒性，400倍镜下能看到点状或者片状游动的小体。提高种板密度加上尽早处理就能降低损失，如果数量太多就换掉血清就行了。 传代虽然看起来简单，但决定了细胞能不能长久存活。 贴壁细胞用胰酶消化的时候浓度怎么选？常规细胞用0.05%的胰酶就够了；难消化的细胞可以升到0.25%，再加点EDTA；当细胞密度超过80%的时候就分步消化：先用低浓度让边缘变圆再用高浓度收尾。 消化时间一定要短点好过于长一点，“圆身”就赶紧收手。时间越精准碎片越少活性越高。 悬浮细胞高密度的时候容易抱团怎么办？先用细胞筛筛掉大团的再离心去掉上清液；不要用太大力吹打。 空泡现象不一定就是正常的状态变化；少数空泡可能是状态下滑；但如果很多细胞都有空泡就说明老化了。通过调整血清浓度、减少传代频率可以部分逆转这种情况；如果代次太高就直接换批次更稳妥。 生长放缓可能有六个原因：消化过度、传代太密、营养失衡、代代相传、状态老化还有隐匿污染没发现——得逐条排查才能对症下药。 最合适的传代时间是汇合度达到70%-80%的时候；别等它们长老再传代；否则容易出现分化、形态变差甚至漂片死亡的情况。 复苏和冻存是细胞保存的关键环节；一步走错就可能全军覆没。 复苏的时候最稳妥的方法是37℃水浴加离心洗尘法：冻存管在水面下快速解冻约60秒；转到无菌区后1000转离心5分钟去掉上清液；加完全培养基放回孵箱；第二天换液一次清除残留的DMSO。 冻存的时候分三步走加上梯度降温最保险：先用PBS洗两遍去代谢废物；再加适量胰酶消化再离心去掉上清液；按5-10×10⁶/ml重悬在冻存液（DMSO不超过10%）里每管1-1.5ml；然后按照不同程序降温扔到液氮里保存。